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    順磁性自旋標記應用于細胞膜研究

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    瀏覽:- 發布日期:2018-09-28 15:56:31【

    [文章導讀] 電子順磁共振(election paramagnetic resonance,EPR)是對含有未成對電子的順磁性物質在磁場中的吸收信號進行檢測的現代分析方法。自從EPR現象被發現以來...

    電子順磁共振(election paramagnetic resonance,EPR)是對含有未成對電子的順磁性物質在磁場中的吸收信號進行檢測的現代分析方法。自從EPR現象被發現以來,EPR理論得到很大發展,儀器技術日益完善,實驗方法不斷改進。其中,利用自旋標記(spin label)對膜流動性以及膜蛋白進行研究的EPR方法十分引人注目。該方法是將順磁性自旋標記物與膜脂結構相連,或者利用標記物的硝基氧與被檢測蛋白質中的氨基酸殘基相連,從而將具有順磁性的結構整合入無順磁性的膜脂以及膜蛋白分子中,再利用自旋標記物的EPR吸收信號進行分析。EPR技術具有高分辨率、高靈敏度的優點,可以得到大量精確的結構信息。

    EPR常用的蛋白質自旋標記物有膽固醇氧化亞氨,脂肪酸氧化亞氨,doxyl-硬脂酸(DSA),3-2-腆醋酸-丙谷胺(IPSL),順丁烯二酰亞胺(MSL),1-烴氧基-2,2,5,5-四甲基-D3-吡咯琳-3-甲基磺酸醋(MTSSL)以及2,2,6,6-四甲基哌啶-1-烴氧基-4-氨基-4-羧酸(TOAC)等。較為常用的IPSLMTSSL是以共價鍵與被測蛋白質中的半胱氨酸殘基結合,在還原條件下,MTSSL與二硫化物的結合是可逆的,而IPSL的結合則更加穩定。這兩個自旋標記物結構類似,都由一個五元環組成。不同的是MTSSL具有雙鍵以及更短的連接,從而連接更緊密,具有更小的結構可變性以及對蛋白質主鏈的變化更敏感。所以,MTSSLIPSL更為常用。


    電子順磁共振波譜儀

    膜蛋白拓撲學主要研究膜蛋白的跨膜方式,即膜蛋白相對于膜的位置信息。利用EPR技術研究膜蛋白質拓撲學,并可以應用于乙酰膽堿受體的拓撲學研究上。利用Fmoc固相肽段合成法將自旋標記物TOAC附加在T.californica AChR的跨膜結構域(M2α)第18位上,形成TOAC18-AChR。體外合成兩種膜雙分子層模型,將合成并經過一系列純化的TOAC18-AChRM2α肽段融合到膜雙分子層模型中。觀察相應的EPR譜線寬度及超精細分裂值,分析得出α螺旋的螺旋運動傾角。

    內在膜蛋白與部分外周膜蛋白能夠與細胞膜形成多種結構形式,并且可根據功能的需要進行結構的改變。EPR技術是一項研究膜蛋白與膜脂相互作用的有力工具。

    利用EPR技術研究了EPSIN-N末端同源性結構域的α螺旋結構與源于生物體的磷脂膜的相互作用。利用基因技術定向誘導大腸桿菌表達帶有ENTH結構域的蛋白質,把自旋標記物MTSSL標記的蛋白質經過分離純化構建在源于生物體的磷脂膜上,進行EPR檢測。從EPR譜線可以分析出α螺旋存在于膜的頭部基團區域。該研究表明EPR技術可以應用于真正細胞膜研究也為更好的模擬細胞環境下膜蛋白與膜脂的相互作用研究提供了依據。

    細胞膜結構與功能的研究是目前細胞生物學研究的一個熱點,尤其是鑲嵌于其中的蛋白質的結構與功能更是該領域研究的難點之一。EPR技術具有高靈敏度、高分辨率的特性,在膜蛋白結構與膜流動性的研究中具有很大優勢。

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